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根據(jù)衛(wèi)生部規(guī)定，HIV抗體陽性報告必須由衛(wèi)生部認證并取得資格的艾滋病病毒抗體確認實驗室出具才有法律效應(yīng)。

 

最常用的HIV抗體確認實驗方法是免疫印跡法（Western Blot，WB）。

 

HIV抗體確認實驗結(jié)果的評價：免疫印跡實驗的結(jié)果是根據(jù)硝酸纖維素條膜特異性HIV抗原位置上出現(xiàn)的帶型不同來判斷HIV抗體為陽性、陰性和不確定。

 

HIV抗體不確定(或可疑)結(jié)果的評價：在某些情況下，樣品顯示不典型的HIV反應(yīng)性條帶圖譜，既不能確定為陽性也不能確定為陰性，稱為HIV抗體不確定或可疑陽性。

 

[測定方法]

免疫印跡法（或蛋白印跡法）。

 

[方法學(xué)原理]

將純化的確診HIV蛋白抗原裂解，然后通過SDS-PAGE按分子量大小將其分離，再轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素薄膜上，并保存于4℃干燥試管內(nèi)，測定時將割成膜條的硝酸纖維素薄膜與待檢樣品反應(yīng)，使其充分接觸。若樣品中含有HIV抗體，將會與膜條上的抗原區(qū)帶結(jié)合，再加上酶標(biāo)抗人IgG抗體，經(jīng)過與底物反應(yīng)顯色，即可形成肉眼可見的不同區(qū)帶。

 

[標(biāo)本準(zhǔn)備]

靜脈抽血2ml，不抗凝。

 

[試劑]

1、轉(zhuǎn)印有HIV I型和Ⅱ型抗原的硝酸纖維素薄膜。

2、酶聯(lián)結(jié)合物。

3、底物及底物緩沖液。

4、洗滌液。

5、穩(wěn)定液。

 

[測定步驟]

1、在免疫印跡法反應(yīng)槽內(nèi)，加入3ml洗滌液。加入待測樣品20ul，混勻。

2、在反應(yīng)槽內(nèi)加入含HIV抗原的硝酸纖維素薄膜液，在室溫環(huán)境中振搖2h，每份樣品為1條。每次測定需附陰性對照、陽性對照。在振搖過程中，應(yīng)使膜條帶有號碼的一面始終保持向上。

3、傾去槽內(nèi)的反應(yīng)液，用洗滌液將各膜條洗5次，每次3min。

4、在各反應(yīng)槽內(nèi)加酶聯(lián)試劑，于室溫環(huán)境中再振搖1h，用洗滌液洗4次，最后用底物緩沖液洗1次。

5、將底物溶液配好后，加入反應(yīng)槽內(nèi)并振搖數(shù)分鐘，待陽性對照出現(xiàn)典型的HIV抗體陽性區(qū)帶后，迅速傾去底物溶液，并加入穩(wěn)定液繼續(xù)振搖30min。然后將膜條取出，避光晾干，判斷結(jié)果。

6、結(jié)果判斷：確認試驗的結(jié)果判定可根據(jù)世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)，即陽性至少1條env帶和1條pol帶；或至少1條env帶和1條、gag帶；或至少1條env帶、1條gag帶和1條pol帶；或至少2條env帶；陰性：無病毒特異帶。可疑：1條gag帶和1條pol帶，或只有g(shù)ag帶或poi帶。

 

[臨床意義]

免疫印跡法是目前公認的確診HIV感染的方法，若檢出3個HIV主要基因(gag、poi、env)產(chǎn)物的抗體為陽性時，可確診為HIV感染。

 

HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的人類慢病毒組，為直徑約100~120nm球形顆粒，由核心和包膜兩部分組成。核心包括兩條單股RNA鏈、核心結(jié)構(gòu)蛋白和病毒復(fù)制所必需的酶類，含有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT，P51/P66)，整合酶(INT，P32)和蛋白酶(PI，P10)。核心外面為病毒衣殼蛋白(P24，P17)。病毒的最外層為包膜，其中嵌有外膜糖蛋白(gp120)和跨膜糖蛋白(gp41)。

 

HIV基因全長約9.8kb，含有3個結(jié)構(gòu)基因(gag、pol、env)、2個調(diào)節(jié)基因(tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表達調(diào)節(jié)子)和4個輔助基因(nef負調(diào)控因子、vpr病毒r蛋白、vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子)。

 

HIV是一種變異性很強的病毒，各基因的變異程度不同，env基因變異率最高。HIV發(fā)生變異的主要原因包括逆轉(zhuǎn)錄酶無校正功能導(dǎo)致的隨機變異、宿主的免疫選擇壓力以及藥物選擇壓力，其中不規(guī)范的抗病毒治療是導(dǎo)致耐藥性的重要原因。

 

根據(jù)HIV基因差異，將其分為HIV-1型和HIV-2型，兩型間氨基酸序列的同源性為40%~60%。目前全球流行的主要是HIV-1(本方案中如無特別說明，HIV即指HIV-1)。

 

HIV-1可進一步分為不同的亞型，包括M亞型組(主要亞型組)、O亞型組和N亞型組，其中M組有A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K11個亞型。此外，近年來發(fā)現(xiàn)多個流行重組型。HIV-2的生物學(xué)特性與HIV-1相似，但其傳染性較低，引起的艾滋病臨床進展較慢，癥狀較輕。

 

HIV-2型至少有A、B、C、D、E、F、G7個亞型。我國以HIV-1為主要流行株，已發(fā)現(xiàn)的有A、B(歐美B)、Bc(泰國B)、C、D、E、F和G8個亞型，還有不同流行重組型。

 

HIV通過各種途徑進入機體后，病毒通過粘附，穿透細胞，復(fù)制等過程完成感染。此時檢測抗-HIV常呈陽性。蛋白條帶會出現(xiàn)gp160、gp41、gp120、p17、p24、p55、p31、p51、p66、p55抗原分子是一種前體分子，在HIV感染早期出現(xiàn)并漸漸地分解成其他核蛋白。gp160是前體分子，在感染初期產(chǎn)生，然后分解成gp120和gp41。gp41蛋白分布在病毒包膜的內(nèi)外層(跨膜糖蛋白)，與HIV-1分型有關(guān)。gp41與gp160共同參與病毒與宿主細胞CD4分子變體的結(jié)合。在檢測到gp160和p55時，說明病毒正在復(fù)制過程中。POL蛋白包括的p66、p51和p31，POL蛋白位于病毒的核區(qū)內(nèi)，與病毒核酸緊密相關(guān)聯(lián)。病毒感染最初階段，ENV(gp160)或GAG(p24)可單獨出現(xiàn)，在感染初期30d，p24與gp160的強度大約會相等，當(dāng)病毒感染2~3個月時，ENV和GAG標(biāo)記物飽和，gp160在6個月時可飽和。隨著時間的推移，病毒過了相對的停滯期，開始大量復(fù)制，這時出現(xiàn)典型蛋白條帶。

 

當(dāng)一個人最近處于血清學(xué)轉(zhuǎn)型時期，很可能在測定時出現(xiàn)不典型的條帶類型。處于低感染的人群，有可能出現(xiàn)不確定結(jié)果。有時不確定反應(yīng)是由于HIV-2型的交叉反應(yīng)所致，比如gp120、p60。有些與HIV-2型感染有交叉反應(yīng)。個別HIV-1型感染也可出現(xiàn)。這是因為艾滋病的自然病種或其他的免疫缺陷所致。p24和p66的抗體會隨著艾滋病的病程進展而降低。另外，患有惡性腫瘤的感染者和接受免疫抑制藥物治療的感染者也有可能不出現(xiàn)陽性反應(yīng)。當(dāng)出現(xiàn)不確定結(jié)果時，建議感染者3~6個月進行復(fù)檢，或檢測病毒核酸或p24抗原，以作為輔助診斷。

 

當(dāng)p17出現(xiàn)時，常伴有p24出現(xiàn)，僅p17出現(xiàn)無臨床意義。當(dāng)單獨出現(xiàn)p68、p56、p40、p34時，可排除HIV感染。對于反復(fù)凍融的血清，ELIAS法檢測抗HIV常呈陽性，同時膠體硒快速診斷也呈陽性，而WB呈陰性結(jié)果。